原理简介
GFP、RFP等荧光蛋白因其的荧光性质和灵敏性，常作为报告基因研究并分析基因产物在细胞中的定位和相互作用等。将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬时转化技术或稳定遗传转化技术，使得该融合蛋白在受体材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器，通过显微镜观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，确定目标蛋白的位置，从而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。
为什么有的基因定位结果与预想的不一致？
对于一个特定的定位载体，只要荧光表达较好，其定位结果是确定的，不会随人为意愿或操作而改变。至于有时候和预想的结果不一样，可能和蛋白本身、选择的表达载体以及荧光蛋白融合方式等有关。
为什么有的普通定位结果出来后无法准确判断其定位位置？
细胞中的细胞器复杂且多样，除一些常见的、特征比较明显的细胞器外，有些细胞器在激光共聚焦下形状比较相似，例如：线粒体、过氧化物酶体、高尔基体等细胞器，它们的荧光表达形状可能都是点状，因此不易区分。这时可以结合基因的其他功能研究来判断其可能表达的位置。另外，蛋白表达本身也是一个复杂的过程，涉及到多个合成场所及转运过程，自身表达情况可能比较复杂，因此不易判断具体的表达位置。
除了洋葱亚细胞定位，还有许多其他亚细胞定位方法。其中，比较常见的有：
荧光法：将学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。用荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等也称为荧光细胞(或组织)化学技术。
GFP融合蛋白表达法：将目的蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达位置。
亚细胞结构分离定位法。
在预测阶段，研究人员会利用机器学习算法和已知的基因表达数据来训练模型，从而识别出可能与特定基因表达相关的启动子序列。这些预测的启动子序列将被用作进一步实验的基础。
在实验验证阶段，研究人员会将这些预测的启动子序列与报告基因（如荧光蛋白）一起插入植物的基因组中，然后观察报告基因的表达情况。如果报告基因的表达模式与预期相符，那么就可以认为这个启动子在促进特定基因的表达方面起着关键作用。
以上信息由专业从事GISH的贝科新肽于2024/5/17 9:01:13发布
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