组织原位杂交(Tissue in situ hybridization）,即原位杂交组织化学技术和原位杂交细胞化学技术
原位杂交技术的基本原理
利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。
1.两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA一RNA或RNA一RNA双键分子
2.应用带有标记的（有性同位素，如3H、35S、32P，荧光素、生物素、等非性物质)DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交
3.用自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位
用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。
此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。
将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。
DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比，DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。
探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列，则可据此设计高度的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补，那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着，探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去，可能无法正确检测。
原位杂交技术的实验结果
原位杂交技术的实验结果包括阳性信号和阴性信号的判断标准。阳性信号是指探针与目标核酸序列特异性结合形成的双链复合物，在显色反应、荧光染色或性同位素标记下呈现出明显的信号。阴性信号是指探针未与目标核酸序列结合，不呈现任何信号。实验结果的分析需要结合探针的特异性和敏感性、组织或细胞的原始结构以及实验条件等因素综合进行。
以上信息由专业从事荧光原位杂交技术的贝科新肽于2024/5/7 5:40:23发布
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